отчего белки расфокусировываются, и оказывается возможным транспорт белков к детектору. Другая возможность мобилизации белков состоит в том, что в капилляре они приводятся в движение по направлению к детектору путем наложения разности давлений (давление или разрежение). При этом, однако, напряжение должно оставаться включенным, чтобы противодействовать уширению полос в процессе детектирования. Поскольку фокусировка происходит во всем капилляре, т. е. в том числе и между ячейкой детектора и катодом, белки с крайне высокими значениями р1 могут уклоняться от детектирования. Этого можно избежать, заполняя капилляр едким натром вплоть до места детектирования.
В качестве примера возможности ИЭФ в капиллярах представлены на рис. 105. Модифицирование стенок капилляра динамическим или ковалентным способом допустимо также и в случае ИЭФ, поскольку здесь, как и в необработанном капилляре, белки сильно адсорбируются на стенках капилляра.
Рис. 105. Разделение 7 белков вследствие различия их изоэлектрических точек.
14. Изотахофорез (ИТФ)
Если описанные до сих пор электрофоретические способы разделения в капиллярах соответствовали элюентной хроматографии (прерывистый ввод проб, постоянный состав элюента, различные скорости движения компонентов пробы), то метод ИТФ соответствует вы-теснительной хроматографии. В обоих случаях все компоненты пробы движутся с одинаковой скоростью. ИТФ описан много лет назад и проводился тогда в основном в тефлоновых трубках. Однако из-за проблем выбора конкретных электролитов и ограничений в выборе детекторов (применимы только детекторы по электропроводности) этот метод было невозможно использовать в качестве точного аналитического метода. В случае ИТФ проба вводится между двумя электролитами с различными подвижностями ионов, выбранными так, чтобы они ограничивали подвижности компонентов пробы. Обычно ведущий электролит обладает наивысшей, а конечный электролит — наиболее низкой подвижностью из всех движущихся ионов. После достижения стационарного состояния все одинаково заряженные ионы движутся с одинаковыми скоростями. На рис. 106 это показано схематически. В каждой зоне при ИТФ имеется своя напряженность поля. Внутри каждой зоны напряженность поля постоянна, изменения происходят скачком на границах зон.
Рис. 106. Схема ИТФ.
По этой причине методом ИТФ разделяли только анионы или катионы. Концентрационный ход в зонах описывается прямоугольной функцией: зоны следуют, как в вытеснительной хроматографии, непосредственно одна за другой. Применяя детектор по электропроводности, получают ступенчатый сигнал.
ИТФ преимущественно применяют для разделения неорганических ионов и органических карбоновых кислот. Из-за проблем детектирования и трудностей, связанных с нахождением подходящих электролитов, для проб неизвестного состава метод ИТФ неприменим. В частности, подходящие носители, т. е. электролиты, необходимы для белков и других сложных смесей, причем для того, чтобы разделять зоны друг от друга, носители должны обладать скоростью, промежуточной между скоростями движения проб. Из-за необходимости поиска подходящих носителей в анализе белков метод ИТФ едва ли найдет широкое применение в биоаналитике. ИТФ, как вытеснительная хроматография, способен концентрировать разбавленные пробы, поэтому он может быть использован на стадии предварительного концентри-рования перед разделением методом КЭ. Этим разрешаются проблемы, связанные с дозировкой относительно больших объемов разбавленных проб.
Стадия обогащения (концентрирования) может проводиться непосредственно в разделительном капилляре КЭ. В капилляр, заполненный разделяющим электролитом, вводится короткая зона несущего элетролита, вслед за которой вводится проба. При этом могут дозироваться объемы пробы порядка микролитров. Обогащение проходит в направлении несущего электролита, при этом возможно концентрирование в 100 раз. В случав белков схожий эффект дает добавка «ацетата аммония к раствору пробы. Ион ацетата в данном случае действует как несущий электролит. Описано также сочетание двух аппаратов с двумя УФ-детекторами, ИТФ для концентрирования и КЭ для разделения. Когда сконцентрированная ИТФ-зона достигает первого детектора, система разделения КЭ переключается.
15. Электрохроматография (ЭХ)
Основной вклад в уширение полос в ВЭЖХ дают параболический профиль скоростей и диффузия в порах стационарной фазы. Одной из возможностей уменьшения этого вклада в уширение полос является уменьшение диаметра частиц, однако при этом возрастает перепад давления. В идеальном случае ЭОП в наполненном капилляре не зависит от размера частиц наполнителя. Кроме того, поршнеобразная форма профиля скоростей ЭОП способствует высокой разделительной способности. Поэтому пытаются соединить высокую селективность заполненной разделительной колонки ВЭЖХ с "остротой" разделения, свойственной КЭ. В данном случае основополагающие принципы разделения и стационарные фазы те же, что в ВЭЖХ, однако транспорт элюентов (водно-органических буферных растворов) и компонентов пробы обеспечивается миграцией под действием электрического поля. Для уменьшения вклада сорбционных процессов в уширение полос применяют очень маленькие непористые частицы (1 мкм). Следует отметить, что до настоящего времени в литературе нет реальных примеров применения, а есть только теоретические работы. Многообещающие теоретические предсказания до сих пор не подтверждены экспериментально. Получаемые малые ВЭТТ лишь незначительно отличаются от полученных в ВЭЖХ. Одной из причин этого может быть проблема детектирования. В КЭ детектируют с помощью разделяющего капилляра, в наполненной колонке это уже невозможно. Таким образом, дополнительно возникают известные в микро-ВЭЖХ проблемы, связанные с подключением детектора к разделяющему капилляру.
Рис. 107. Разделение с помощью ЭХ в капилляре, наполненном обращенной фазой. Последовательность элюирования: тио-мочевина, бензиловый спирт, бензальдегид, бензол, 1,2-дихлорбекзод, 1,2,3-трихлорбензол, 1,2,3,4-тетрахлорбензод, пентахлорбензол, гексахлорбензол.
Условия разделения: длина капилляра 28.5 см, 50 мкм, наполнитель — Hypersil ODS (3 мкм), ввод пробы: 2.5 кВ в течение 5 с, наложенное поле 45 кВ (2 мкА), детектирование при 220 нм, подвижная фаза — 2 мМ динатрийтетраборат, 80 % апетонитрил, pH 8.7.
16. Перспективы
В таблице 31 представлены описанные разделительные системы, применение которых основано на миграции, обусловленной электрическим полем. Наиболее часто применяемой системой является, конечно, КЭ в кварцевых капиллярах (открытых трубках) с незаполненными или поверхностно-модифицированными стенками капилляра. Нейтральные молекулы также могут быть разделены в этих системах с помощью добавок мицеллообразователей.
По сравнению с классическим электрофорезом КЭ имеет следующие преимущества:
— очень высокая эффективность разделения;
— простое детектирование в режиме реального времени и возможность количественного анализа;
— простота хранения;
— короткие времена анализов;
— возможность автоматизации;
— небольшой расход реактивов.
По сравнению с ВЭЖХ преимущества заключаются в следующем:
— высокая эффективность разделения;
— быстрое установление равновесия при изменении условий анализов.
Недостатки КЭ заключаются в следующем:
— детектирование УФ-детекторами с низкой чувствительностью к изменению концентрации;
— относительно плохая воспроизводимость и сложность управления ЭОП;
— адсорбция анализируемых веществ на стенках капилляра, приводящая к потере эффективности.
В настоящее время коммерчески доступны приборы, некоторые из них — второго поколения, позволяющие проводить рутинные измерения, Это отражается также на характере публикаций число работ, ориентированных на практику, перекрывает число чисто методических или теоретических работ. В 1990 году в обзоре по аналитической химии под рубрикой "Капиллярный электрофорез" приведены только 225 работ, из которых более половины относились к 1988/89 годам, а в