разрешения при высоких значениях pH часто объясняется тем, что очень высокий ЭОП не дает достаточно времени анализируемым веществам для разделения в капилляре. Высокий ЭОП приводит к слишком коротким временам пребывания анализируемых веществ в капилляре. При очень высоких значениях pH ЦД сами могут депротонироватъся, из-за чего селективность снова изменяется. Если ЦД имеет одинаковый заряд с анализируемыми веществами, из-за электростатического отталкивания хиральные отличительные черты теряются.
11.7. Оптимизация фоновых электролитов
После выбора подходящего хирального селектора и оптимального значения pH следует оптимизировать также ионный состав разделяющего буфера. Как показано на рис. 90, подвижность буферных ионов влияет на форму пика и разрешение анализируемых веществ.
Рис. 90. Влияние фонового электролита на форму и разрешение пиков.
Условия разделения: 1=20/27 см, покрытие полиакриламидное, Е=370 В/см (выход заземлен), об. 0.3 % гидроксипропил-р-ЦД, детектирование при 214 нм, пробы: дансил-фенилаланин (1), производное дигидропиридина (2). А) 10 мМ лимонная кислота, pH 6.0. В) 25 мМ MES/Tpuc, pH 6.0. С) 20 мМ фосфатный буфер, pH 6.0.
Во всех трех случаях выдерживались одинаковые условия ввода пробы, и все условия разделения, за исключением буферных ионов, поддерживались одинаковыми. Ясно видно, что в случае применения в качестве буфера лимонной кислоты получается лучшее разрешение и, как следствие, более высокая эффективность разделения. Это приводит также к большей чувствительности системы. Этот пример показывает, что и при низких значениях а путем улучшения эффективности можно достичь достаточного хорошего разрешения анализируемых веществ.
11.8. Буферные добавки
Наряду с уже описанными параметрами определяющее влияние на разделительную способность хирального селектора могут оказывать многие добавки к разделяющему буферу. Однако заранее невозможно предсказать, может ли добавка таких компонентов, как органические растворители, комплексообразующие средства, детергенты и т. д., привести к улучшению или исчезновению разделения.
В некоторых публикациях предпринята попытка представить модель такого поведения. В нижеописанном уравнении приведены основные факторы, влияющие на различия подвижностей.
Здесь
Δμ — разность подвижностей энантиомеров,
μ1 — подвижности энантаомера 1 или 2 в свободном растворе,
μ2 — подвижности комплексов "энантиомер-ЦД",
[С] — коцентрация хирального детектора,
Ка, Кв — констаны равновесия между энантиомером А или В и ЦД.
Разность подвижностей и, соответственно, селективность зависят в основном от концентрации ЦД, констант равновесия между анализируемыми веществами и хиральным селектором и разности подвижностей в комплексном и некомплексном состояниях анализируемых веществ. Из вышесказанного следует, что при постоянной концентрации ЦД добавка органического компонента к буферу может изменить константу равновесия в положительную (улучшение разрешения) или отрицательную (потеря разрешения) сторону. Характер изменения зависит в основном от концентрации
На рис. 91 представлено влияние мочевины, метанола и ДДСН на время миграции, проявление пика и разрешение. Для буферного раствора, насыщенного (3-ЦД (об. 1.56 %), в данном примере наблюдается наиболее быстрое время миграции (А).
Рис. 91. Влияние буферных добавок на разделение энантиомеров.
Условия разделения: L 40/47 см, Е=232 В/см, (анод на стороне детектора), капилляр с покрытием (4 % линейный полиакриламид), детектирование при 214 нм; буфер: 0,1 М ТВЕ, pH 8.3, добавки-.А) об. 1.56 % р-ЦД. В) об. 12 % р-ЦД, 7 М мочевина, 0.1 % ДДСН. С) об. 12 % р-ЦД, 7 М мочевина, 10 % метанол, 0.1 М ДДСН,D) об. 12 % р-ЦД, 7 М мочевина. Е) об. 12 % р-ЦД, 7 М мочевина, 10 %) метанол.
С помощью добавки раствора 7 М мочевины можно поднять концентрацию ЦД (случай D). Однако, в данном случае время анализов заметно растет вследствие увеличения вязкости буфера и низкой подвижности анализируемых веществ, обусловленной высокой концентрацией хирального селектора. При этом улучшения разрешения не наблюдается. В данном случае положительное влияние оказывает добавка метанола (Е). Время миграции при этом несколько возрастает, однако достигается лучшее разрешение. Если использовать буфер, соответствующий случаю D, вместе с 0.1 М ДДСН, время миграции резко уменьшается (случай В). Это объясняется тем, что в данных условиях ДДСН и анализируемые вещества движутся в одном направлении (оба анионные), тем самым создается синергический эффект. Разрешение по сравнению со случаем (D) резко улучшается, а время анализов уменьшается. И в этом случае добавка метанола в буферную систему приводит к увеличению времени анализов, однако улучшения разрешения не наблюдается (случай С). В рассматриваемых здесь случаях улучшение разрешения определяется в основном более высокой эффективностью конкретной разделяющей среды. Значения а в этих примерах практически не изменяются.
12. Капиллярный гель-эпектрофорез
Сильный подъем в применении КЭ, особенно КГЭ, а также появление в продаже промышленных приборов связаны с американским проектом "Геном человека". С помощью метода КГЭ практически полностью были разделены молекулы ДНК в реакции определения последовательности нуклеотидов ДНК или остаточных фрагментов. Из применяемых типов гелей в классическом планарном гелевом электрофорезе в капиллярах в качестве матриц применяют в основном акриламид, агарозу и целлюлозу. Эти гели очень сильно различаются по своим физическим свойствам, таким как вязкость, стабильность в электрическом поле, пористая структура и размер пор.
Применение гелей в электрофорезе основано на том, что биополимеры с точки зрения зарядов являются полианионами или поликатионами с одинаковыми поверхностями, поэтому разделение в постоянном электрическом поле без дополнительных вспомогательных средств становится невозможным. Поскольку эти биополимеры в самом деле резко различаются по своим размерам, добавка некоторого геля может сильнее влиять на подвижность полимера с большими размерами молекул. Это приводит впоследствии к разделению молекул по размерам, т. е. по растущим ММ. Основной областью применения гелевого электрофореза является разделение молекул ДНК, а также разделение белков, которые подвергаются денатурированию в растворе ДДСН. Кроме того, гели в классическом электрофорезе применяются обычно в качестве стабилизаторов, хотя и не дающих вклад в разделение.
Ниже будут рассмотрены некоторые типы гелей и показаны основные области их применения в КЭ.
12.1. Гели на основе акриламида
В общем случае различаются гели, обладающие определенной степенью поперечной сшивки (поперечносшитые гели), состоящие из двух мономеров, и гели, состоящие только из одного мономера (линейные гели). Последние сплетены только из линейных полимерных цепочек, и их связи основаны только на физическом взаимодействии (физические гели). Поперечносшитые гели, в отличие от линейных, состоят из отдельных полимерных цепочек, поперечно связанных друг с другом и, тем самым, обладают более жесткой структурой (химические гели), поскольку между волокнами существуют ковалентные связи. К тому же эти гели содержат в достаточном количестве поры определенного размера, что обеспечивает их высокую разделительную способность.
На рис. 92 представлены структуры применяемых радикалов-стартеров и мономеров, а также схематический разрез гелевой структуры.
Рис. 92. Структура мономера — акриламидного геля с разрезом гелевой структуры.