Показаны также структуры радикалов-стартеров.
Сравнение "линейного" и "сшитого" полиакриламидов представлено на рис. 93.
Рис. 93. Схема структуры линейного и поперечносшитого полиакриламидов.
12.1.1. Поперечносшитые полиакриламидные цепи
Важнейшей предпосылкой применения геля (в классическом смысле) в капилляре является полное исключение ЭОП.
Если это условие не выполняется в достаточной степени, гель вымывается из капилляра наружу, и разделение становится невозможным. Регулирование ЭОП достигается нанесением слоя или химическим модифицированием капилляра, которые уже подробно рассматривались в разделе о способах нанесения покрытий капилляров.
За то время, когда раствор мономера смешивают с радикалом-стартером и катализатором и быстро заполняют капилляр, гель в капилляре полимеризуется.
В некоторых случаях покрытия стенок капилляра, например, виниловыми группировками, гель при полимеризации в капилляре может сшиваться с нанесенным поверхностным слоем. Этот способ дает высокую целостность покрытия капилляра и, как следствие, приводит к очень высокой эффективности. Используя этот метод с применением поперечносшитых и связанных со стенкой капилляра ковалентными силами гелей, удалось получить наивысшие эффективности в КЭ (30 млн. теоретических тарелок на метр).
Селективность гелей можно изменять с помощью выбора отношения концентрации наносимого мономера (%Т) к концентрации сшивающего агента (% С).
Свойства поперечносшитых гелей на полиамидной основе приведены в таблице 28.
Однако, перечисленные гели имеют некоторые недостатки:
— во время хранения капилляров, заполненных такими гелями (в отсутствие смачивания концов капилляра буфером) гель на концах капилляра может высохнуть, и, таким образом, капилляр становится непригодным для дальнейшей работы,
— обмен в среде буфера в капилляре невозможен или требует длительного времени,
— термостабильность такого рода гелей недостаточна. Растворенные газообразные компоненты буфера при высоких температурах образуют пузыри в капилляре. Похожий эффект наблюдается также в сильных полях (>500 В/см). Образование воздушных пузырей в капилляре, заполненном гелем, всегда приводит к локальным нарушениям геля и непригодности капилляра,
— поскольку для разделения применяют всегда один и тот же гель, неизбежны явления старения, вызванные "обескровливанием" геля. По сравнению с этим в классическом гелевом электрофорезе применяют всегда только одну зарядку гелем на один анализ, что может устранить этот эффект,
— изготовление самодельных капилляров (как было принято) требовало многих "ноу-хау" при модифицировании поверхности и, особенно, при проведении полимеризации в капилляре.
Эти проблемы стали причиной того, что попытки промышленного выпуска таких капилляров потерпели неудачу. На рис. 94 в качестве примера показана огромная производительность при разделении олигонуклеотидов таким поперечносшитым полиакриламидным гелем.
Рис. 94. Разделение поли(уридин-5'фосфата).
Условия разделения: L=45, Е=300 В/см, буфер: 0.1 М Тряс, «0.25 М борная кислота, 7М мочевина, 6 % Т, 5"/о С, полиакриламид, детектирование при 260 нм.
12.1.2. Линейные полиакриамидные гели.
Вышеописанные проблемы в основном преодолеваются при применении в капиллярах несшитых гелей. Свойства этих гелей при их использовании в капиллярах сильно зависят от концентрации мономера. В таблице 29 приведены свойства и основные области применения несшитых полиакриламидных гелей.
При низких концентрациях мономера акриламида уже нельзя говорить о геле в обычном смысле этого слова, поскольку до концентрации примерно 4 % Т имеет место только жидкий, хорошо текучий высокомолекулярный раствор полимера. Эти полимерные растворы можно назвать также "жидкими гелями", "полимерными матрицами" или "буфером с ситовыми свойствами". Такие растворы можно вводить в капилляр под давлением, под которым они находятся в сосуде с буфером. Это делает возможной легкую замену "жидких гелей" в капилляре после каждого анализа. Тем самым, перед каждым разделением будет иметься в распоряжении свежая, ненапряженная разделительная матрица, что отражается положительно на стабильности метода и результатах анализа. Таким образом, в данном случае образование пузырей и высыхание капилляра исключаются. Это показано на рис. 95, где приведены данные после 400 анализов, показывающие, что капилляр все еще работоспособен.
Для достижения высокой эффективности и селективности и в этом случае следует останавливать ЭОП. Любой поток внутри капилляра уменьшает эффективность разделения. Следует также упомянуть, что в случае применения этих гелей возможна также работа с капиллярами без покрытия. В общем случае разрешение будет хуже, причем разделение начинается при достаточно высоких ММ. В покрытых капиллярах разделяются вещества с достаточно длинными цепочками.
Рис. 95. Тест на стабильность капилляра, покрытого линейным полиакриламидом (ЛПА).
Условия разделения: L=30/37 см, Е=300 В/см, температура 30 °C, 3 % Т, 0 % С, ЛПА, 0.1 М ТВЕ, pH 8.3. Проба: Phi X 174 RFHHK Нае III; А — 1-ый, В — 144-ый, С — 344-ый, D — 420-ый опыты.
На рис. 96 показано разделение остаточных фрагментов в капилляре, покрытом линейным гелем (3 % Т, 0 % С).
Рис. 96. Разделение остаточных фрагментов ДНК в капилляре, покрытом ЛПА.
Условия разделения: L=40/47 cm, Е=150 В/см, I=50 °C. Буфер: 0.1 М ТВЕ, pH 8.3, 3 % Т, 0 % С ЛПА, пробы: pBR 322 MSP I, pBR 322 Hae III, детектирование: 254 нм.
Поскольку все фрагменты присутствуют в эквимолярных соотношениях, но большие фрагменты обладают большим числом адсорбционных центров, с ростом длины цепочек растет и площадь пиков. По этой причине маленькие фрагменты дают маленькие пики и, вследствие малого сопротивления миграции в геле, на фореграммах проявляются в первую очередь. Нумерация фрагментов ДНК в данном случае проводилась в предположении роста молекулярных размеров. Число ступеней разделения здесь равно примерно 600 тысячам теоретических тарелок на метр. При таких высоких числах ступеней разделения капилляры желательно располагать в горизонтальном положении, поскольку поворот капилляра может привести к потере эффективности. Эти потери эффективности, зависящие от расположения капилляра, наблюдаются в КЭ при очень высоких эффективностях (> 1 млн. теоретических тарелок).
Большое влияние на селективность и эффективность оказывает также температура. Вообще эффективность падает с ростом температуры, однако для фрагментов некоторых размеров может достигаться лучшее разрешение, что обусловлено улучшающейся селективностью. Влияние температуры, напряженности поля, пористой структуры геля и буферных добавок на селективность и последовательность миграции анализируемых веществ будет рассматриваться в дальнейшем при обсуждении моделей миграции.
В случае более высоких концентраций мономера растворы полимера становятся высоковязкими, поэтому начиная с концентрации 8 % их следует полимеризовать в капилляре. Селективность этих высокомолекулярных линейных гелей (например 12 % Т) схожа с селективностью поперечносшитых гелей, которые всегда следует полимеризовать в капиллярах. Поскольку, однако, в таких гелях не образуются ковалентные связи цепочек между собой, а также со стенками капилляров, сильное напряжение геля не приводит к разрушению его структуры. Эта незафиксированность цепочек в геле придает полимеру большую гибкость и, вследствие этого, повышает его продолжительность жизни. На рис. 97 представлено разделение олигонуклеотидного стандарта в