селективность. В этой области молекулы анализируемых веществ больше, чем поры геля, так что молекула может проникнуть в поры только в вытянутом состоянии, огибая в "змеевидном" движении волокна гелевой матрицы (рептация). Таким образом, могут возникнуть сильные взаимодействия анализируемых веществ с матрицей геля, что приводит к появлению максимума селективности.
C) При средних длинах цепочек анализируемых веществ достигается минимум подвижности. Это объясняется тем, что оба конца молекулы движутся в одном направлении и сильно переплетаются с волокнами разделяющего полимера (ловушка). Это приводит впоследствии к уже независящей от размеров молекул подвижности (аномальная миграция и даже инверсия). Однако это переплетение для маленьких молекул не играет существенной роли, т. к. они могут быстро освободиться от такой конформации. Для больших молекул вероятность выхода из такого состояния очень мала.
D) В последней области при очень больших длинах молекул различия анализируемых веществ относительно их размеров становятся все меньше, что приводит в дальнейшем к отсутствию различий в подвижностях.
Как видно из рис. 102, экспериментально полученные зависимости согласуются с теорией.
Рис. 102. Зависимость между подвижностями смеси остаточных фрагментов ДНК и числом основных пар в логарифмическом масштабе.
Условия разделения: L=40/47 см, буфер: 0.1 М ТВЕ, pH 8.3, 3 % Т, 0 % С, ЛПА, различные температуры и силы поля (указаны на рисунке).
Однако, было обнаружено, что сильное влияние на правильную последовательность миграции (маленькие молекулы перед большими) и подвижность анализируемых веществ оказывают также температура, сила поля и концентрация геля. В экстремальных случаях может наблюдаться инверсия последовательности миграции, т. е. более длинные фрагменты ДНК движутся сквозь разделяющий гель быстрее, чем меньшие фрагменты ДНК. Это нежелательное явление можно в общем случае устранить следующими способами:
— уменьшением напряжения налагаемого поля,
— повышением температуры в системе,
— уменьшением концентрации геля,
— буферными добавками.
Качественно нелинейность подвижности можно описать также моделью рептации:
Здесь μ — подвижность биополимера, Q — общий заряд молекулы, f — коэффициент трения между волокнами геля и полимером, N — число сегментов биополимера (число основных пар), q — заряд на величину N, Е — сила поля, а — длина поры геля, Т — температура и Кь — константа Больцмана. Из этого уравнения видно, что подвижность обратно пропорциональна длине цепочки только в том случае, когда второй член пренебрежимо мал. Это бывает только при работе с относительно слабыми полями (<200 В/см). Согласно этому соотношению следует работать при повышенных температурах, что также подтверждается на практике.
В зависимости от размеров пор геля и длины биополимера наблюдается различная конформация анализируемых веществ между волокнами полимера. Эти конформации в конце концов ответственны за различную подвижность и наблюдаемые нерегулярности. Ясно, что компактная или напряженная конформация вызовет подвижность, отличающуюся, например, от подвижности для вытянутой формы.
Конформации, показанные на рис. 103, можно наблюдать методом лазерной флуоресцентной микроскопии.
Рис. 103. Зависимость подвижности биоподимеров от их конформации в разделяющем геле (см. также рис. 100).
Вышеупомянутые модели миграции описывают и объясняют все наблюдаемые картины и аномалии. С помощью этих моделей можно также объяснить причины нелинейности между последовательностью миграции и размерами молекул и устранить их.
13. Изоэлектрическая фокусировка (ИЭФ) в капиллярах
В классической форме электрофореза ИЭФ представляет собой разработанный способ разделения с высокой эффективностью. В основном он применяется для цвиттерионов и амфотерных проб, таких как белки и пептиды, которые различаются не по своей подвижности, а по изоэлектрическим точкам (значениям pi). Изоэлектрическая точка представляет собой специфическую величину для амфотерных веществ и показывает, при каком значении pH это вещество перестает двигаться в электрическом поле и внешне выглядит как электрически нейтральное. Таким образом, ИЭФ можно применять также для определения изоэлектрической точки белков и других амфотерных веществ.
Сначала необходимо вдоль участка разделения с помощью цвиттерионных соединений, так называемых амфолитов, создать градиент значений pH. В качестве амфолитов применяют смесь различных полиамино-поликарбокси-кислот, различающихся по своим значениям Pi.
Под влиянием сильной кислоты в анодном и сильной щелочи в катодном пространствах эти амфолиты при наложении напряжения располагаются согласно своим значениям р! вдоль участка разделения и, тем самым, создают градиент pH (см. рис. 104).
Рис. 104. Принцип ИЭФ.
а) наложение градиента pH; Ь) ввод пробы; с) установление равновесия (устойчивое состояние); d) зависимость силы поля (сплошная линия) и значения pH (штрихи) от расстояния на участке разделения.
Этот градиент в случае классического электрофореза на плоской подложке стабилизируется с помощью геля для удаления конвекционных потоков. Белки движутся под действием градиента pH до тех пор, пока сохраняют заряд. При значении pH, соответствующем их изоэлектрической точке, электрофоретическая миграций заканчивается. Высокая эффективность ИЭФ основывается на фокусирующем свойстве градиента pH, который практически не допускает уширемия полос, вызванного диффузией. Амфолиты можно или добавлять к буферу, или ковалем-то связывать с гелем (иммобилизованный градиент pH (ИГП)). Этот вариант ИЭФ вследствие очень крутого градиента pH ведет к очень высокой разделительной способности. Чем меньше различия в значениях р! пробы, тем более резкие градиенты pH необходимо накладывать для того, чтобы обеспечить разделение этих проб.
При переносе ИЭФ на узкие капилляры применение стабилизирующих гелей не является безусловно необходимым. Правда, ЭОП необходимо полностью подавить для того, чтобы сделать возможным образование градиента pH, иначе ЭОП быстро вынесет раствор амфолита из капилляра и сделает невозможным проведение фокусировки. Управлять ЭОП можно, как уже отмечалось в одной из глав, модифицируя поверхность капилляра. Понижать ЭОП для проведения фокусировки можно также, добавляя высоковязкие полимеры, например, метилцеллюлозу, для повышения вязкости буферного раствора. Преимущество последнего способа заключается в том, что зачастую для ИЭФ необходимо применять очень высокие значения pH, а ковалентное покрытие капилляра не может долго выдерживать сильнощелочные значения pH.
В отличие от ИЭФ на плоской подложке в капилляре образование градиента pH и фокусировка белков протекают в одну стадию. Капилляр заполняют раствором амфолита, уже содержащим пробы, и катодный конец капилляра погружают в разбавленный раствор едкого натра, а анодный конец — в разбавленный раствор фосфорной кислоты. При наложении напряжения сначала протекает большой поток, поскольку амфолиты еще движутся до своей изоэлектрической точки и, тем самым, вносят вклад в общий поток. Окончание фокусировки выражается падением потока до постоянной небольшой величины. После того, как пробы сфокусированы и разделены в капилляре, они должны пройти через детектор. Это достигается в общем случае заменой катодного электролита (сильного основания) на сильно кислотный раствор или заменой анодного электролита (сильной кислоты) на сильное основание.
При этом проводящееся титрование разрушает градиент pH,