при основных pH (!). Подробная ЭОП/pH — характеристика, а также зависимость от количества нанесенного ПЭИ показана на рис. 69.
Рис. 69. Зависимость ЭОП от pH (ЭОП/рН-характеристики) капилляров с нанесенным ПЭИ при различных концентрациях
Как и ожидалось, с ростом значения pH буфера ЭОП увеличивается, т. к. при этом резко ускоряется депротонирование аминогрупп. Кроме того, в данном случае нельзя также полностью влияние поверхностных исключить силанольных групп (депротонирование в щелочи!).
Применимость. Наряду с интересными свойствами по отношению к ЭОП, капилляры, покрытые ПЭИ, пригодны также для разделения белков. (Отталкивание положительно заряженных белков от стенки капилляра!). (Рис. 70).
Рис. 70. Разделение стандартных белков в капилляре, покрытом ПЭИ.
Буфер: 20 мМ гидроксиламин/НС1, pH 7,0: пробы: 1 — мезицилоксид, 2 — миоглобин кита, 3 — БСА, 4 — хямотрипси-моген А крупного рогатого скота, 5 — цитохром С лошади, 6 — лизоцим.
9.3.2.4. Покрытие капилляров поли (метилглутаматом)
Исходным соединением для изготовления этого полипептидного покрытия является мономер М-карбоксиангидрид гаммаметилглутамата. Сначала проводят адсорбцию этого соединения на стенку капилляра, затем с помощью нагревания с одновременным расщеплением диоксида углерода проводят полимеризацию.
Электроосмос. Вследствие того, что нанесенный полимерный слой очень тонок, 5 ЭОП уменьшается незначительно и стенка капилляра экранируется не полностью.
Применимость. Капилляры с поли(метилглутаматовым) (ПМГ) покрытием пригодны для разделения белков. Кроме того, ими можно разделять комплексные смеси ферментов (рис 71).
Рис. 71. Разделение целлюлозного комплекса ферментов в капилляре с ПМГ-покрытием.
Буфер: 30 мМ фосфат, pH 7,0.
9.3.2.5. Капилляры для ГХ и СКФХ с нанесенным полимером, используемые в КЗ.
Еще на начальной стадии развития в КЭ было предложено использовать капилляры с нанесенными полимерами, применяемые в ГХ. При этом преследовалась цель регулировать ЭОП в МЭКХ с помощью капилляров, покрытых полиметилсилоксаном (ПМС) или ПЭГ.
При использовании неполярного ПМС-покрытия в МЭКХ с ДДСН в качестве мицеллообразователя ЭОП возрастает по сравнению с использованием необработанного капилляра. Это приводит к более коротким временам анализа, но одновременно с этим и к меньшим площадям пиков. Увеличение электроосмоса можно объяснить адсорбцией молекул ПАВ на гидрофобной поверхности и, как следствие, повышением ^-потенциала. В случае полиэтиленгликолевого покрытия наблюдается обратный эффект, т. е. меньшая скорость потока, большие времена анализа и большие площади пиков. Это значит, что такое покрытие экранирует поверхностные силанольные группы, однако, вследствие гидрофильного характера ПЭГ-цепочек, дополнительной адсорбции ДДСН не происходит. Областью применения таких капилляров является разделение фенолов и производных нитробензола, в частности, производного пурина и циклических оснований.
9.4. Выводы
Применение кварцевых капилляров с покрытием для КЭ описаны в последние годы многими авторами. Однако до настоящего времени коммерчески доступны капилляры только с очень ограниченным числом типов покрытий:
1. Applied Biosistems (Foster City, California) предлагают катионные реагенты, которые дают положительно заряженные покрытия и, тем самым, приводят к обращению направления ЭОП. Этими покрытиями также заметно понижаются взаимодействия белков со стенками капилляров при значениях pH ниже их изоэлектрической точки.
2. BioRad (Hercules, California) предлагают капилляры, модифицированные гидрофильными покрытиями. Тем самым, как ЭОП. так и адсорбция биомолекул уменьшаются.
3. Supeico, Inc. (Bellefonte, Pennsylvania) предлагает различные связанные фазы. Тем самым, кроме уменьшения адсорбции белков должно обеспечиваться постоянство ЭОП в области pH от 3 до 10. Предлагаемыми к продаже фазами являются: нейтральные гидрофильные, слабо гидрофобные фазы С1, гидрофобные фазы С8 и сильно гидрофобные фазы С18.
4. Isco, Inc. (Lincoln, Nebraska) предлагает три фазы для покрытий: ковалентно связанную фазу С18 (белки), глицериновое покрытие (белки, пептиды) и сульфокислотное покрытие (нуклеотиды).
5. Коммерчески доступны также капилляры с различными полимерными покрытиями для применения в ГХ.
Тот факт, что в торговле других предложений нет, показывает, что многие покрытия не соответствуют требованиям рутинных аналитических измерений. Так, получаемые обычными способами слои на стенках капилляров являются прежде всего гидролитически нестабильными, тем более, что в КЭ многие разделения проходят в среде сильных оснований. Кроме того, экранирование активных адсорбционных центров на стенках капилляров является в большинстве случаев неполным, так что их применение для разделения белков достаточно условно.
Полимерные покрытая проявляют себя в последнем случае лучше, однако, как показывают опыты по разделению белков, и здесь при рН>9 не обеспечивается гидролитическая стабильность.
Что касается разделения биомолекул, то ни одно из известных покрытий не позволяет одинаково хорошо разделять сильно различающиеся пробы (белков). Поэтому цель дальнейших исследований в этой области должна заключаться в получении более стабильных и универсальных покрытий.
В таблице 25 проведено сопоставление различных свойств модифицированных и немодифицированных капилляров.
10. Мицеллярная электрокинетическая хроматография
В КЗЭ нейтральные пробы достигают детектора вместе с катионами и анионами и не могут быть разделены. Метод МЭКХ, предложенный Терабе и др. в 1984 году, позволяет разделять незаряженные компоненты пробы за счет различной вероятности нахождения их в водной подвижной и псевдостационарной фазах. С помощью добавок детергентов к буферу при превышении ККМ образуются мицеллы. Эти мицеллы носят гидрофобный характер внутри и заряжены снаружи, чем и достигается электрофоретическая подвижность в электрическом поле. В зависимости от знака заряда эта электрофоретическая подвижность направлена в сторону катода или анода. МЭКХ может быть реализована в той же аппаратуре, что КЗЭ и требует лишь добавок детергента. Наиболее часто в качестве детергента применяют ДДСН. Получаемые мицеллы имеют отрицательный заряд и, как следствие, приобретают электрофоретическую подвижность в направлении анода. По аналогии с КЗЭ эффективная скорость перемещения компонентов пробы, так же, как и мицелл, представляет собой векторную сумму электрофоретической и электроосмотической скоростей. На рис. 72 представлена схема разделения посредством МЭКХ. Речь идет о наиболее часто встречающемся случае, когда анионный детергент растворен в нейтральном или щелочном буфере.
Рис. 72. Механизм разделения в МЭКХ
ЭОП направлен в сторону катода. Если вклад электрофоретической подвижности мицелл меньше вклада электроосмотической подвижности, то мицеллы движутся в сторону катода, т. е. в сторону детектора. Полярные молекулы, которые задерживаются только в водной фазе, движутся со скоростью электроосмотического потока и, спустя "мертвое" время, достигают детектора. Сильно гидрофобные молекулы пробы задерживаются прежде всего внутри мицелл и движутся со скоростью мицеллы. Следовательно, задержанные молекулы пробы появляются в детекторе в отрезок времени между to и tMC. Получаемое разделение нейтральных веществ основано на их различном распределении между буферным раствором и внутренней частью мицелл. Вследствие того, что молекулы пробы взаимодействуют с псевдостационарной фазой, точность метода МЭКХ соответствует точности обычного хроматографического метода.
Значение k', по аналогии с хроматографией, можно определить как соотношение между числом молекул пробы