к обращению направления ЭОП в кислотах. Кроме того, хранение капилляров в этом случае возможно только при добавлении консервантов, защищающих покрытие от повреждения микроорганизмов.
Применимость: Покрытия на основе диола, ПЭГ и мальтозы в основном используются для разделения белков в КЭ. Разделение стандартных белков показано на рис. 65.
Рис. 65. Разделение белков в капилляре, покрытом ПЭГ.
Буфер: 30 мМ фосфат, pH 3.8; пробы: 1 — цитохром С, 2 — лизоцим, 3 — миоглобин, 4 — трипсин, 5 — РНК, 6 — трипсиноген, 1 — химотрипсиноген.
В заключение можно отметить, что и в случае гидрофильных покрытий капилляров или на первой стадии синтеза введенной "подложки" поверхность покрывается недостаточно плотным слоем, так что зачастую взаимодействия поверхности с пробой подавляются не полностью.
9.3.1.4. Покрытия на основе белков
Изготовление. Внутренние стенки капилляров можно покрыть не только углеводородами, но и белками, например, альфа-лактальбумином. Для того, чтобы свободные альдегидные группы служили центрами связи с белками, в капилляре, модифицированном аминогруппами, сначала проводится реакция обмена с глутардиальдегидом. Впоследствии эти группы реагируют с введенным в капилляр белком.
Электроосмос. Покрытия на основе белков показывают интересную зависимость ЭОП от pH. Вследствие того, что белки имеют амфотерные свойства, выше своих значений pi они существует в анионной, а ниже — в катионной формах. Если значения pH буфера соответствуют значениям pi, то белки незаряжены. Следовательно, в этой точке электроосмос должен падать до нуля, или, соответственно, менять направление на противоположное при переходе через эту точку. Таким образом, в принципе существует возможность подбором определенного белка или амфотерных молекул регулировать силу и направление ЭОП.
9.3.2. Полимерные покрытия
9.3.2.1. Покрытия на основе линейных полиакриламидов
Поперечносшитые полиакрилимидные гели оказались прекрасными носителями и разделительными матрицами для электрофоретического разделения белков в способах, основанных на плоском слоевом электрофорезе, таких как ДИСК-электрофорез, ДДСН-ПААГ-электрофорез или ИЭФ. Это указывает на гидрофильный характер таких гелей, которые проявляют только слабые взаимодействия с биомолекулами. В КЭ возможно также покрытие кварцевой поверхности акриламидом.
Изготовление. В двухстадийной реакции стенка капилляра сначала обрабатывается гаммаметакрилоксипропилтриметоксисиланом в разбавленной уксусной кислоте.
Нанесенные таким способом виниловые группы на второй стадии реакции сополимеризуются в водном растворе с акриламидом В качестве радикального инициатора реакции служит персульфат аммония, а катализатором является N,N,N’,N’-тетраметиленэтилендиамин (ТМЭД) (рис. 66).
Рис. 66. Схема, образования полиакридамидного покрытия.
Электроосмос и стабильность. ЭОП полностью подавляется при покрытии поверхности капилляра линейным полиакриламидом. Стабильность таких капилляров при низких pH (до 3) очень высокая, однако в щелочной среде при рН>8 они нестабильны. Эта нестабильность проявляется в постепенном появлении ЭОП, а также колебаниях времени миграции проб.
Применимость. С учетом простоты производства, а также доступности приобретения покрытия на основе линейных полиакриламидов нашли широкое применение. В первую очередь речь идет не только о разделении белков, но и некоторых биомолекул — таких, как фрагменты ДНК.
На рис. 67 показано разделение стандартных проб при pH 2.8. Несмотря на заметно возросший ЭОП, можно работать с нормальными полями, так что разделение заканчивается примерно через 5 минут.
Рис. 67. Разделение стандартных белков при проверке стабильности капилляра, покрытого полиакриламидом.
Буфер: 30 мМ цитрат, pH 2.8; пробы: А — лизоцим, В — РНК. С — химотрип-синоген.
Вследствие того, что покрытия на основе линейных полиакриламидов позволяют полностью подавить ЭОП, можно перенести такой классический способ разделения, как ИЭФ, на КЭ.
В области биологически важных проб наряду с белками определенную роль играют также нуклеотиды, олигонуклеотиды и фрагменты ДНК. Такого рода пробы в КЭ до настоящего времени разделяли методом МЭКХ, а также полиакриламидгелевым КЭ. Покрытия на основе линейных полиакриламидов в сочетании с макромолекулярными буферными добавками можно привлечь для разделения фрагментов радикалов ДНК в широкой области.
Использование покрытых капилляров для этих целей представляется вполне выгодным, поскольку проблемы, связанные с использованием капилляров, заполненных гелем (образование пузырей, воспроизводимость и стабильность гелей) еще не решены. Наконец, капилляры, покрытые линейными полиакриламидами, можно использовать также для изготовления гельзаполненных капилляров.
9.3.2.2. Покрытия на основе поли(винилпирролидона)
Капилляры, покрытые поли(винилпирролидоном) (ПВП) успешно применяли для разделения белков методами гельпроникающей эксклюзионной хроматографии (ГПХ) и хроматографии гидрофобного взаимодействия (ХГВ) в ВЭЖХ. Применению ПВП в качестве покрытия уделяется внимание также в КЭ.
Изготовление. На первой стадии на стенку капилляра наносится виниловое покрытие. На заключительной стадии проводят сополимеризацию с 1-винил-2-пирролидоном в водном растворе с использованием ТМЭД в качестве катализатора и персульфата аммония как радикального инициатора реакции.
Свойства и применимость. Оптимальная рабочая область для такого типа покрытий для разделения белков приходится на область сильных кислот, в которой капилляры сохраняют стабильность в течение нескольких недель. На рис. 68 показано разделение 15 (!) стандартных белков в области р! от 4.5 до 11 (!) и ММ от 12000 до 77000. Эффективность достигает 700000 теоретических тарелок в течение 25 минут. Покрытия на основе ПВП для кварцевых капилляров являются высокопроизводительными и при использовании в области, кислотных pH вполне конкурируют с покрытиями на основе линейных полиакриламидов.
Рис. 68. Пример разделения белков в капилляре с ПВП-покрытием.
Буфер: 58.5 мМ фосфат, pH 2.0; пробы: А — бэта-лактогдобулин В, В — бэта-лактоглобулин А, С — лизоцим, D — серумальбумин человека, Е — РНК крупного рогатого скота, F — цитохром С, G — трипсиноген, Н — миоглобин кита, I — трансферрин, J — кональбумин, К — миоглобин лошади, L — карбоксиангидраза В, М — карбоксиангидраза А, N — гемоглобин, О — парвальбумин.
9.3.2.3. Покрытие капилляров поли(этиленимином) (нанесение ионных слоев)
Поли(этиленимин) (ПЭИ) является положительно заряженным полимерным покрытием, которое закрепляется на стенке капилляра под действием электростатических взаимодействий.
Изготовление. Способ нанесения такого покрытия похож на способ нанесения покрытия из анионообменных материалов на полимерные и силикатные подложки для ВЭЖХ: при этом сначала на поверхности носителя адсорбируются первичные ПЭИ с различными ММ и концентрацией, затем производится их поперечное сшивание.
В качестве сшивающего агента служит в данном случае этиленгликольдиглицидилэфир. ПЭИ содержит сдвоенные полимерные цепи с первичными, вторичными и третичными аминогруппами в соотношении 1:2:1. Эти функциональные группы делают возможными как электростатические взаимодействия, так и поперечную сшивку.
Электроосмос. Вследствие того, что концентрация основных аминогрупп в полимере высока, в широкой области pH покрытие остается заряженным положительно, что приводит к обращению направления ЭОП. При этом абсолютные значения элетроосмотических подвижностей, которые для данных покрытий достигаются при низших pH, лежат в той же области, что и скорости потоков для необработанных капилляров