капилляр с помощью газового потока. Важными условиями при этом являются смачиваемость стенок растворителем, малый поверхностный заряд раствора и, прежде всего, отсутствие пыли. В качестве растворителя применяют в основном дихлорметан и пемтан.
Гомогенность и толщина полученного покрытия определяются в первую очередь концентрацией раствора. Полуэмпирическая оценка толщины пленки di может быть проведена по следующему уравнению:
di = С∙r/200(ηU/σ)1,2,
где С — концентрация в об.%, r — радиус, U — линейная скорость, η — вязкость, σ — поверхностное натяжение.
Для 10 % раствора в области реализируемых скоростей достигается толщина пленки от 0.2 до 1 мкм. Процесс покрытия заканчивается сушкой в инертной атмосфере и, при необходимости, полимеризацией или поперечным сшиванием.
При статическом методе капилляр также заполняется разбавленным раствором стационарной фазы. После запаивания одного конца капилляра пары растворителя пропускаются через другой конец при нагревании и/или под давлением. Этот метод предъявляет существенно более высокие требования к аппаратуре и методике. Предпосылкой гомогенного покрытия являются, в частности, постоянная температура и тщательное дегазирование.
Несмотря на то, что оба метода очень надежны в ГХ, до настоящего времени в КЭ они применяются довольно редко. Большинство авторов ограничиваются тем, что, как в ЖХ, наносят силаны за счет выдерживания в растворе и нагревания. Тем самым, коммерчески доступные капилляры обладают худшей стабильностью и воспроизводимостью покрытия. Кроме того, при этом теряется важная информация о модифицированной поверхности (толщина пленки и др.).
В ГХ и ЖХ стандартная фаза характеризуется с применением многочисленных стандартных тестов и тестовых смесей. Кроме того, в ЖХ существуют многочисленные независимые физико-химические методы, например, элементный CHN-анализ, ИК-фурье-спектроскопия или ЯМР, способные дать информацию о модифицировании поверхности. Использование в КЭ трубок небольшой длины (<1 м) с крайне малым внутренним диаметром (<100 мкм) и, как следствие, малой внутренней поверхностью (<1 см2) делают невозможным применение инструментальных физико-химических методов.
Исходя из этого, в качестве характеристики покрытия капилляров используется изменение ЭОП, вызванное покрытием. Вследствие того, что в большинстве случаев покрытия делаются для подавления взаимодействия белок-стенка, естественно, что в качестве меры качества модифицирования поверхности может служить разделение стандартных смесей белков.
Характеристики неполярных или гидрофобных покрытий можно получить с помощью газохроматографических измерений. Для определения толщины пленки исследуются времена удерживания н-нонана как стандартного вещества. Для характеристики оставшихся силанольных групп служат времена удерживания различных полярных веществ.
9.3. Обзор важнейших химических покрытий
9.3.1. Общепринятые покрытия
9.3.1.1. Алкил-силановые покрытия
Изготовление. Применение и реакционная способность моно-, ди- и трифункциональных алкилсиланов уже давно известны в ГХ и ВЭЖХ, поэтому здесь подробно на этом останавливаться не будем. Получаемая в результате поверхность имеет более или менее гидрофобный характер ("обращенная фаза"), в зависимости от длин цепочек нанесенных алифатаческих остатков. Благодаря слабой реакционной способности алкокси-силанов их можно наносить из водных растворов.
Электроосмос. При добавлении поверхностных силанольных групп с нейтральными (незаряженными) алкилсиланами ЭОП уменьшается. На рис. 61 представлены зависимости электроосмоса от значения pH буфера для кварцевого капилляра, покрытого С8 и 018, по сравнению с исходным капилляром. Видно, что поток уменьшается примерно на 40 % от исходного значения, и в этом случае трудно определить точку перелома. Меньший поток в 08-капилляре вероятно объясняется лучшим покрытием поверхности, т. к. "щетка" С8 предъявляет меньше стерических требований, чем С18.
Рис. 61. ЭОП/рН-характеристики различных покрытий (типов "щетки")
Стабильность. Из применения в хроматографии известно, что алкилсилановые покрытия стабильны по отношению к гидролизу только при pH 7. На рис. 62 показано изменение времени миграции некоего нейтрального маркера в течение 80 опытов при pH 7 для названных выше капилляров. Модифицированные капилляры показывают явный спад времени движения в течение первых 20 опытов. Возможные объяснения этого заключаются либо в потере несвязанного материала, либо в частичном гидролизе алкильной "щетки" на поверхности. После этого состояние капилляра, покрытого по крайней мере С8, стабилизируется.
Рис. 62. Стабильность покрытий (типы "щетки"), литература Supelco.
Применимость. В капиллярах с покрытиями С8 и С18 может быть проведено разделение белков. Однако покрытия алкилсиланами имеют два больших недостатка: с одной стороны — гидрофобный характер алкильной "щетки", с другой стороны — неполное экранирование поверхностных силамольмых групп, которые все еще взаимодействуют с белками.
9.3.1.2. Арилпентафторидные покрытия
Изготовление. Синтез проводится по описанным стандартным методам с применением двухстадийной реакции: после обработки стенки гаммааминопропилтриметоксисиланом нанесенные аминогруппы обмениваются с пентафторобензоилхлоридом в сухом толуоле.
Электроосмос. Особенность арилпентафторидного (АПФ) покрытия заключается в том, что, в отличие от многих других покрытий, при нейтральном pH и средних ионных силах появляется отчетливый ЭОП (0.5 мм/с).
Применимость. Как показывают специальные хроматографические опыты, АПФ-покрытия также относятся к гидрофобным. Поэтому АПФ-капилляры можно с успехом использовать при pH 7 для разделения белков. Для тестовых смесей с белками, которые перекрывали область pH от 6.9 до 11, получали эффективность в многие сотни тысяч теоретических тарелок на метр (рис. 63). Благодаря вкладу электроосмоса в условиях проводимого анализа можно разделять как катионные, так и анионные белки за один проход.
Рис. 63. Структура АПФ-покрытия.
Пример разделения белков (А) с помощью покрытия АПФ; (В) — в капилляре из плавленного кварца; буфер — 200 мМ КС], pH 1; пробы: L — лизоцим, D — ДМСО, R — РНК крупного рогатого скота, Т — трипсиноген, WM — миоглобин кита, НМ — миоглобин лошади, НСА-В — карбоксиангидраза В человека, ВСА-В — карбоксиангидраза крупного рогатого скота.
9.3.1.3. Гидрофильные гидрокоил- и полиэфирные покрытия
Изготовление. В ЖХ для разделения белков в основном используются гидрофильные фазы, например, с диол-полиэтиленгликолем (ДПЭГ) или полисахаридами. Кварцевые капилляры также можно модифицировать этими функциональными группами.
В данном случае для синтеза используются двухступенчатые реакции, на первой стадии которых применяют, например, глицидсилан. Он может впоследствии либо гидролизоваться диолом, либо соединиться с глицерином или полиэтиленгликолем (рис. 64). Нанесение углеводородов происходит на первой стадии с помощью аминофункци-ональных групп, с которыми впоследствии можно связать мальтозу с использованием, например, циано-боргидридного катализа.
Рис. 64. Схема синтеза ПЭГ-покрытия.
Электроосмос и стабильность. При покрытии диолом и полиэтиленгликолем (ПЭГ), как и ожидалось, электроосмос резко уменьшается. (В случае диола mэоп=0.1 см2/кВс для 50 мМ фосфата и pH 6). Рабочая область для таких капилляров ограничивается значениями pH от 3 до 5. Долговременная стабильность в этих условиях достигает нескольких месяцев. При покрытии мальтозой возможна работа в области pH от 3 до 7. Вследствие того, что при нанесении аминосиланов с мальтозой реакции обмена подвергаются не все функциональные аминогруппы, при низких значениях pH поверхность заряжается положительно.
Это приводит