количество хромосомных аномалий.
Эффект обработки реверсином был преходящий, и как только Хелен вымывала препарат, контрольная точка сегрегации восстанавливалась. И это важно, поскольку мы могли ограничить присутствие хромосомных аномалий конкретным «окном» развития эмбриона.
Удостоверившись, что можем создавать аномальные клетки, мы решили узнать, могут ли обработанные реверсином эмбрионы вообще развиваться. Хелен обработала реверсином четырехклеточные эмбрионы и обнаружила, что через четыре дня они создали меньше клеток, чем необработанные эмбрионы. Но, несмотря на это, они по-прежнему сформировали три базовых типа клеточных линий.
Чтобы выяснить, могут ли обработанные реверсином эмбрионы превратиться в мышей, нам надо было подсадить их приемным матерям. Это происходило до того, как мы научились культивировать эмбрионы in vitro. И пока среди нормальных эмбрионов на каждые десять приходилось семь имплантированных, у обработанных реверсином эмбрионов данное соотношение было вдвое меньше. Важно отметить, что ни один обработанный реверсином эмбрион не смог превратиться в жизнеспособную мышь. Эти эксперименты показали, что, когда значительное количество клеток эмбриона имеет хромосомные аномалии, эмбрионы погибают, даже если им удается имплантироваться и какое-то время развиваться.
Теперь мы могли сосредоточиться на главном вопросе: как развивается эмбрион, если только часть его клеток имеет хромосомные аномалии? Чтобы ответить, нам надо было создать мозаичные эмбрионы, у которых аномальные клетки существовали вместе с нормальными, и мы решили провернуть это путем создания химер вроде тех, что делала Каролина (см. главу 5).
Мы не могли создать мозаичный эмбрион, поскольку не могли обработать реверсином лишь несколько клеток в пределах одного эмбриона, чтобы сделать их аномальными, и выбрали альтернативный подход, основанный на создании химер из клеток разных эмбрионов (мозаичный эмбрион развивается из одной оплодотворенной яйцеклетки). Химеры были предпочтительнее мозаичных эмбрионов, потому что позволяли планомерно выяснить, какое количество аномальных клеток нарушает процесс развития. К счастью, подход сработал.
Хелен обработала каждый эмбрион реверсином в момент перехода из двухклеточной стадии в четырехклеточную, а по достижении восьмиклеточной стадии разделила эмбрион на отдельные. Затем она смешала четыре клетки нормального эмбриона с четырьмя клетками обработанного реверсином и получила восьмиклеточный химерный эмбрион.
Чтобы отследить судьбу каждой клетки, нужно было найти маркер. Мы воспользовались линией мышей, созданных моими друзьями из Нью-Йорка, Кэт Хаджантонакис и Джинни Папайоану, с генетическими изменениями, способствующими экспрессии GFP в клеточном ядре [2]. Мы использовали эмбрионы этих мышей для того, чтобы обработанные и необработанные реверсином клетки были разного цвета — только так их можно было отличить. Клетки, экспрессирующие GFP, визуально демонстрировали точное время и место рождения новой клетки, ее последующие деления, а также время и место смерти, если клетка не выживала. Так мы могли нарисовать для каждой клетки целое «фамильное древо».
Мы снимали фильмы о судьбе индивидуальных клеток, как уже делали однажды, когда пытались понять, в какой момент клетки эмбриона склоняются на определенный путь развития (глава 4). Хелен наблюдала прямо на экране, как количество аномальных клеток уменьшалось преимущественно в той части эмбриона, которая генерировала ткани нового организма, то есть в эпибласте. Аномальные клетки умирали в процессе апоптоза — запрограммированной клеточной гибели. Частота апоптоза в той части эмбриона, которой суждено было стать собственно эмбрионом, была более чем в два раза выше среди обработанных реверсином клеток, чем среди контрольных, необработанных.
Эксперимент показал, что аномальные клетки в основном уничтожались в той части эмбриона, которая должна была превратиться в плод. Это подтверждало мою гипотезу о том, что аномальные клетки в этой части эмбриона проигрывают нормальным, хотя я не угадала сам механизм.
Мне даже не верилось. Это был первый намек на то, что мы и впрямь на что-то наткнулись и что эмбрион способен к самовосстановлению точно так же, как и к самоорганизации.
(Когда я еще носила под сердцем Саймона, могло ли случиться так, что клетки с хромосомной аномалией, чьих потомков показал тест CVS, самоликвидировались в той части эмбриона, которая превратилась в Саймона? Но в тот день я поехала забирать Саймона из школы и все ему объяснила, хотя сомневалась, что он поймет. Но тем вечером, пока мы с ним рисовали и танцевали, я уверена, он осознал, что произошло нечто судьбоносное.)
Хотя сердце стучало «да-да», рациональный ум говорил «может быть». Прежде чем делать однозначный вывод, предстояло столько всего исследовать. Например, судя по моему тесту (как и по любому аномальному результату теста CVS), аномальным клеткам удается попасть в трофэктодерму, которая превращается в плаценту. Но почему они не ликвидируются путем апоптоза? Является ли эта часть эмбриона более терпимой к клеткам с хромосомными аномалиями? Как выглядит сигнал, запускающий механизм уничтожения аномальных клеток? Они убивают себя сами или при помощи окружающих нормальных клеток, «выигравших» конкурс на выживание?
По ряду причин, от бытовых до научных, на изучение этих вопросов ушли годы, да и ответить удалось только на некоторые. Например, мы выяснили, что в трофэктодерме аномальные клетки выживают, хотя делятся медленнее. Исследование 1346 индивидуальных клеток показало, что в трофэктодерме апоптоз происходит не так часто (2% клеток), но опять же, частота апоптоза среди аномальных клеток выше (3,3%), чем среди контрольных (0,6%). Аномальные клетки постепенно продолжают делиться, рождая потомство для будущей плаценты, поэтому их можно обнаружить в результате анализа, например, того самого теста CVS, который я проходила. Мы предполагаем, что у человеческих эмбрионов происходит то же самое.
Эти эксперименты показали, что та часть эмбриона, которая развивается в собственно эмбрион, а затем — в мышонка, может самостоятельно избавляться от клеток с аномальным набором хромосом. Эмбрион оказался способен как к самоорганизации, так и к самовосстановлению. Это был существенный результат. Однако важно подчеркнуть, что не все аномальные клетки были уничтожены. Происходит ли это позже? Продолжается ли подобная самокоррекция после имплантации? Мы не могли тогда выяснить, поскольку еще не умели культивировать эмбрионы после стадии имплантации. Этот оставшийся вопрос только сильнее мотивировал меня на то, чтобы придумать способ выращивания эмбриона после имплантации в культуре.
Работа была не закончена. Оставался центральный вопрос о том, могут ли уцелевшие в мозаичном эмбрионе нормальные клетки компенсировать уничтоженные аномальные. И самое главное: если могут, то какое количество нормальных клеток должно присутствовать в мозаичном эмбрионе, чтобы обеспечить его восстановление?
В поисках ответа мы решили создать мозаичные химерные эмбрионы, у которых соотношение контрольных (нормальных) клеток к обработанным реверсином (аномальным) клеткам составляло 1:1 или 1:3, а затем подсадить их приемным самкам. Вскоре после имплантации Хелен их извлекла. Поразительно, но все мозаичные эмбрионы 1:1 выглядели такими же нормальными, как контрольные, указывая на то, что, если в эмбрионе остается лишь половина нормальных клеток, их по-прежнему достаточно