Святой Иоанн по милости Божией возвращенный народною любовию на свой престол и оправданный от состоявшагося над ним осуждения новым собором из 65 епископов, начал попрежнему право править делами церкви Христовой и из уст его попрежнему полились сладостныя для слуха и сердца беседы и поучения. Водворился опять мир, но к несчастью не надолго. Это было лишь временное затишье перед новой бурей и еще более яростной. Хотя враги Иоанна присмирели, но в сердце своем они затаили еще более смертельную вражду и злобу против него и ждали перваго удобнаго случая, чтобы вновь обрушиться на ненавистного им святителя, который не только своими обличительными беседами, но еще более своею праведною жизнью служил нестерпимым укором для всякой неправды, злобы и порочности. И первой зачинщицей бури опять выступила императрица Евдоксия, которая, оправившись от волнения и страха, вновь начала враждебно относиться к архиепископу. При необузданности нрава царицы, не терпевшей ни малейшаго препятствия в стремлении к ненасытному тщеславию, столкновение между нею и святителем не заставило себя долго ждать, и оно произошло чрез два месяца по возвращении Златоуста на свой престол по следующему случаю. Чувствуя, что она именно глава государства, а не малодушный и ничтожный Аркадий, Евдоксия заявила притязание на небывалую для императриц почесть – сооружение особой колонны, увенчанной серебряным ея изображением, на самой важной площади столицы, около церкви св. Софии. Это необузданное честолюбие Евдоксии возбудило даже негодование на западе и Гонорий счел своим долгом предостеречь своего брата Аркадия от подобнаго нарушения древних обычаев; но Евдоксия ничего не хотела знать, и колонна с ея серебряной статуей на вершине была поставлена при всевозможных торжествах и ликованиях. Вследствие близости колонны к церкви, шум этих непристойных торжеств с языческими церемониями и плясками делал невозможным самое богослужение, и так как они продолжались несколько дней, то святителю не могло не показаться все это явным и даже намеренным оскорблением святыни. Сначала он хотел чрез префекта устранить это кощунство; но когда префект не оказал ему в этом отношении никакого содействия, то он произнес резкую обличительную беседу, которую, по свидетельству историков, начал знаменитыми словами: "Опять беснуется Иродиада, опять мятется, опять рукоплещет и пляшет, опять главы Иоанновой ищет". Доносчики и враги Иоанна не преминули с злорадством довести об этом до сведения царицы, истолковав эти слова в том смысле, что в них она сравнивается с Иродиадой, и Евдоксия пришла в полное неистовство, с плачем жаловалась царю на нанесенное ей оскорбление и требовала, чтобы вновь был созван собор для низвержения невыносимаго дня нея иерарха. К Феофилу полетели от нея письма, в которых она умоляла его вновь приехать в Константинополь и докончить низвержение Иоанна. Тот, конечно, рад бы был исполнить просьбу царицы, так совпадавшую с его собственным желанием; но полученный им раньше урок, когда он едва не побит был камнями от народа, заставил его быть поосторожнее, и он, не желая вновь подвергать себя опасности, отправил вместо себя трех епископов - заместителей, снабдив их необходимыми наставлениями, и между прочим канонами, на основании которых можно было осудить Иоанна. Эти каноны были арианскаго происхождения, составлены были некогда арианами на Афанасия Великаго и следовательно не имели силы для православной церкви; но так как в них заключалось одно постановление, весьма пригодное в данном случае, именно, что епископ, раз низвергнутый собором, не может вновь занимать престола без отмены прежняго постановления другим большим собором, то Феофил ничтоже сумняся и настаивал на применении этого правила к Иоанну, который-де вновь занял свой престол просто по распоряжению царя и воли народа, без правильнаго соборнаго определения. Собор действительно опять составился почти из тех же епископов, которые заседали и "При дубе", и конечно произнес новое осуждение на Иоанна, обвиняя его именно в нарушении указаннаго канона. Осуждение это было вдвойне незаконно, потому что в данном случае канон, составленный еретиками с явно злонамеренною целию - погубить великого поборника православия, был неприменим и потому, что в действительности Иоанн по возвращении из ссылки был оправдан от осуждения его придубским собором со стороны большаго собора, состоявшаго из 66 епископов; но злоба врагов не признавала никаких доводов, и Иоанн был объявлен низвергнутым и это постановление утверждено императором.
Таким образом над главою многострадальнаго Иоанна опять разразилась громовая туча: он опять был в опале и извержен из своего сана. Наученный горьким опытом из прежняго случая, император однако опасался теперь прибрать к насилию над низвергнутым святителем и хотел заставить его удалиться добровольно, стараясь при всяком случае доказывать ему, что он больше не архиепископ и незаконно занимает престол. Так в праздник Рождества Христова 403 года император не хотел принять от него св. причастия. В таком неопределенном положении дело оставалось до самой Пасхи. Наконец царь, наущаемый Евдоксией, которая не давала ему покоя, пока еще оставался на своем престоле ненавистный ей святитель, порешил к светлому празднику Христову совсем удалить Иоанна и послал ему приказ оставить церковь. Св. Иоанн, исполненный сознания своей правоты и пастырскаго долга, отвечал, что он не оставит церкви, которая вверена ему Христом Спасителем, чтобы не понести ответа за самовольное оставление ея. Пусть изгонят его силою, и тогда на него не падет вина эта. Царь заколебался от такой стойкости святителя; но видя над собою неумолимую тираннию Евдоксии, порешил так или иначе покончить с этим тяжелым делом. Придворному сановнику Марину поручено было силою удалить Иоанна из церкви, где он уже готовился совершить св. крещение над 3,000 оглашенных. Сановник исполнил приказ с полицейскою точностью, и светлый праздник был омрачен безобразными сценами дикаго насилия (16 апр. 404 г.). Силою ворвавшись в церковь, полуварварские воины, под начальством язычника Луция, начали безпощадно громить все, предаваясь всяким буйствам и грабежу. Те, кто пытались защитить святителя, были избиты, духовенство выгнано из храма и даже полураздетые оглашенные, уже приготовившиеся для крещения, выгнаны были на улицу, евхаристия осквернена и священные сосуды ограблены. Мерзость запустения водворилась на месте святе, и до глубины души огорченный святитель был заключен в патриаршем доме, где он и оставался еще два месяца под домашним арестом. Положение его с каждым днем становилось все тяжелее и он находил себе единственное утешение в молитве, да в обществе близких ему лиц, среди которых истинным ангелом хранителем для него была благочестивая диаконисса Олимпиада. Ища себе защиты от злобы врагов, Иоанн в это время обращался с письмами к влиятельным епископам запада - к папе Иннокентию I и архиепископам Венерию медиоланскому и Хроматию аквилейскому. Эти иерархи глубоко сочувствовали константинопольскому святителю, ужасались силе злобы его врагов, но помочь были не в состоянии. Медлительность дела между тем все более ожесточала его смертельных врагов, и вокруг патриаршаго дома стали появляться подозрительныя и темныя личности, которыя прямо покушались на жизнь святителя. У ворот патриаршаго дома был схвачен верным Иоанну народом один мнимо-бесноватый, у котораго оказался спрятанным кинжал, припасенный с преступною целию. В другой раз обратил на себя внимание какой то раб, который в необычном волнении и торопливо пробирался к патриаршему дому. Заподозрив его в злом умысле, кто-то задержал его и спросил, что он так торопится, а тот ничего не отвечая ударил его кинжалом. При виде этого другой вскрикнул от ужаса, а он и его ударил кинжалом, а потом и третьяго, подвернувшагося под руку. Поднялись крики и вопли, а раб бросился бежать, размахивая окровавленным кинжалом и отбиваясь от гнавшагося за ним народа. В одном месте его хотел перенять человек, только что вышедшей из общественной бани, но был замертво поражен кинжалом. Когда наконец этот разъяренный зверь был схвачен, то сознался, что был подкуплен за пятьдесят золотых убить Иоанна. После этого несчастнаго случая народ стал неотступно охранять дом своего гонимого архипастыря и среди него начались волнения, которыя угрожали страшными ужасами и мятежами. Тогда, чтобы предупредить напрасное кровопролитие, смиренный святитель порешил, как и в первый раз, добровольно отдать себя в руки светской власти. Созвав в последний раз всех своих приближенных, он убедил их быть твердыми в православной вере и дал им последнее целование. Прощание было глубоко трогательное. Все плакали горькими слезами; плакал и сам святитель. И затем, положившись на Промысл Божий, без воли Котораго не падет волос с головы, святитель малыми дверьми вышел из дома и незаметно направился к морю, где его взяли воины и, посадив в лодку, перевезли в Вифинию.