Особо большое внимание московские правители уделяли монастырю в XVI столетии. В 1528 году великий князь Василий III ездил в далекий Кириллов монастырь с княгиней Еленой Глинской молиться о даровании наследника. Последовавшее за этим рождение сына - будущего царя Ивана Грозного - в глазах современников связывалось с заступничеством преподобного Кирилла. Известно, что Грозный на протяжении всей своей жизни питал к монастырю особое пристрастие, трижды посещал его, делал богатые вклады (только деньгами более 24 тысяч рублей). Перед смертью принимая схиму, он, как и его отец Василий III, стал пострижеником Кириллова монастыря.
Растущее богатство монастыря позволило ему развить бурную строительную деятельность. Уже к концу XVI века за каких-нибудь сто лет на месте деревянных монастырских строений возник один из крупнейших по тому времени архитектурных комплексов, по количеству каменных зданий сопоставимый только с наиболее почитаемым монастырем - Троице-Сергиевым. Несколько уступая ему протяженностью каменных стен (585 саженей), он превосходил его числом храмов. Вновь сооружаемые церкви богато украшались иконами и всевозможной утварью. В их изготовлении, так же как и в строительстве, принимали участие и местные монастырские мастера. В частности, иконописец монах Александр выполнил в 1585 году роспись Святых ворот. Но больше всего местные иконники писали небольшие образа для раздачи богомольцам. В начале XVII века около монастыря находился отдельный двор, где жили иконники, серебряники и другие ремесленники, работавшие на монастырь.
Монастырь был не только местом сосредоточения художественной деятельности, но и центром культурной жизни в более широком понимании. Еще при основателе монастыря Кирилле положено было начало собиранию и переписке книг. В монастыре долгое время работала книгописная мастерская, оставившая богатое наследство. Часть книг не только переписана, но и создана в Кириллове, в частности, Кирилловский летописец, содержащий ценные сведения об истории монастыря и некоторые полемические произведения. Активный участник книгописания Гурий Тушин собственноручно переписал 37 книг, большая часть которых дошла до нашего времени. В кирилловском книжном собрании, обширном и разнообразном по составу, хранились книги и светского содержания. Из кирилловской библиотеки происходит древнейший список "Задонщины" - произведения, посвященного описанию Куликовской победы. Ценнейшая кирилловская рукописная коллекция в конце XIX века передана в Санкт-Петербург в Императорскую Публичную библиотеку, где хранится и сейчас.
Составленная в 1601 году по повелению Бориса Годунова и дошедшая до нас опись Кирилло-Белозерского монастыря позволяет воссоздать его облик в тот период. Как основной - Успенский, так и возникший рядом с ним в XVI столетии малый Ивановский монастыри были обнесены каменными стенами с восемью башнями. Внутри стен располагались девять каменных церквей, колокольня, различные хозяйственные постройки. Монашеские кельи и окружавшие монастырь дворы были тогда деревянными.
Удаленный от Москвы, обнесенный прочными стенами Кириллов монастырь на протяжении веков был одним из главнейших мест ссылки. Условия нахождения в нем ссыльных были весьма различны: от проживания в довольно льготных условиях (свои хоромы, свои слуги, особый стол) до строгого заточения.
Среди сосланных в Кириллов встречается немало известных в русской истории имен. Так, в 1499 году был подвергнут опале и отправлен в Кириллов монастырь один из приближенных бояр Ивана III - Василий Косой-Патрикеев, постриженный под именем Вассиана. В дальнейшем ему предстояло занять одно из ведущих мест в лагере нестяжателей. В годы боярского правления при малолетнем князе Иване Васильевиче (Грозном) был низложен группировкой Шуйских и сослан в Кирилло-Белозерский монастырь митрополит Иоасаф Скрипицын. В бурное царствование Ивана Грозного Белозерье стало местом не только ссылки, но и прибежищем для опальных вельмож, пытавшихся, нередко безуспешно, укрыться от царских палачей под монашеской рясой. Так, в 1560 году после отстранения от власти круга влиятельных царских советников, известных под именем "избранной рады", один из виднейших государственных деятелей этого периода, священник московского Благовещенского собора Сильвестр добровольно принял пострижение в Кириллове монастыре. Позднее его примеру последовали боярин Иван Васильевич Шереметев-большой и многие другие. Особое место в истории белозерской ссылки занимает один из последних на Руси удельно-княжеских родов - род князей Воротынских, ведущих свою родословную от Рюрика. Еще в 1534 году заточен в Белоозере и здесь умер полководец, прозванный "победоносным воеводой", Иван Михайлович Воротынский. Его сыновья также были выдающимися военачальниками. Владимир Иванович, участник казанского похода, умер в Кириллове в 1553 году, где и был похоронен. Его более известного брата Михаила Ивановича, отличившегося при взятии Казани, а в 1572 году отразившего войска крымского хана, ссылали на Белоозеро дважды. Первая его ссылка в 1561 году продолжалась четыре года. Второй раз он был схвачен по приказу Грозного в 1577 году и после пыток умер по дороге к месту ссылки. Позднее, при царе Федоре Иоанновиче заточили на Белоозере одного из влиятельнейших бояр, князя Ивана Петровича Шуйского, прославившегося защитой Пскова от войск Стефана Батория. В 1587 году он умер в монастыре, как полагают, насильственной смертью. В 1606 году в конце своей многострадальной жизни был насильственно пострижен в монастырь касимовский царевич Симеон Бекбулатович. В 1574 году по прихоти Грозного его провозгласили в Москве царем, через год низложили и сослали в Тверь; позднее, по повелению Годунова он был ослеплен, возвращен при Лжедмитрии, но ненадолго. Новый царь Василий Шуйский, не слишком уверенный в своих династических правах, поспешил упрятать показавшегося ему опасным конкурента в дальний монастырь на Белоозеро. Из отбывавших ссылку в Кириллове в ХVII веке наиболее крупной фигурой был, безусловно, патриарх Никон. В 1676 году, после смерти царя Алексея Михайловича, его перевели сюда под особо строгий надзор из соседнего Ферапонтова монастыря, где он содержался до этого. Лишь через пять лет, уже смертельно больной, Никон получил разрешение вернуться в основанный им подмосковный Воскресенский Новоиерусалимский монастырь, но так и не добрался туда, скончавшись по дороге. Как место заключения Кириллов использовался до второй половины XIX века, но среди его узников известных исторических лиц мы уже не находим.
Во время польско-литовского нашествия Кириллов монастырь оказался одной из немногих крепостей на северо-востоке Руси, способных оказать сопротивление неприятелю. Впервые отряды интервентов появились в Белозерье в 1612 году. В августе они подошли к стенам монастыря, разграбили и пожгли посады, но попытки взять монастырь не сделали. В декабре отряды, руководимые паном Бобовским и полковником Песоцким, снова осадили монастырь и в ночь на 11 число произвели ожесточенный приступ. Находившиеся в монастыре стрельцы, монастырские крестьяне, служки и сами монахи оказали упорное сопротивление. Многих "воровских людей" убили, а часть утонула в озере, в прорубленной во льду перед стенами борозде. Был убит пушечным выстрелом и сам полковник Песоцкий, и противнику пришлось отступить от монастыря. Польско-литовские отряды продолжали опустошать Белозерье и в последующие годы. Вплоть до 1616 года монастырь находился под постоянной угрозой нападения.