вязкости, перпендикулярный электрофоретическому потоку. При этом тепло будет отводиться через различные материалы с различной скоростью.
Рис. 11. Градиент температуры в буфере для разделения и на стенках капилляра.
В то время как вода обладает относительно высоким тепловым сопротивлением (6.0∙10-3 Вт/см К), через кварц тепло будет отводиться быстро (тепловое сопротивление 1.4∙10-2 Вт/см К). Типичное значение для разницы температур между внутренними и внешними стенками капилляра лежит в интервале между 0.3 и 0.7 °C.
Как показывают расчеты, при этом образуется параболический температурный градиент. Середина капилляра нагревается наиболее сильно, и температура здесь может быть на 10 °C выше, чем на внутренней стенке капилляра. Радиальный температурный градиент вызывает градиент вязкости, который оказывает влияние на профиль потока. Поэтому вещество перемещается медленнее в зоне с высокой вязкостью (стенки капилляра), чем в зоне с меньшей вязкостью (середина капилляра). Образование температурного градиента сильно зависит от размеров капилляра, электропроводности буфера и охлаждения капилляра. Охлаждение капилляра усиливает температурный градиент, однако оно необходимо для того, чтобы избежать дегазации и локального перегрева. Различие в вязкости между серединой капилляра и стенками приводит к различию переноса и, как следствие, к уширению полос и потере эффективности разделения.
Влияния радиальных градиентов температуры и вязкости можно избежать только за счет уменьшения диаметра капилляра.
Разница в температуре между серединой капилляра и стенками в цилиндрической трубке возрастает пропорционально квадрату диаметра капилляра. Поэтому в КЭ применяют очень тонкие капилляры (диаметром от 50 до 100 мкм). Сам градиент температуры не может быть измерен из-за очень малых размеров капилляра. При уменьшении диаметра оптическая плотность слоя и, вместе с тем, чувствительность обнаружения уменьшаются (закон Ламберта-Бера). Другая возможность уменьшения влияния джоулева тепла состоит в снижении концентрации буфера и/или применении буфера с низкой ионной электропроводностью.
Так как повышение температуры увеличивает электропроводность буфера в капилляре, ток при постоянном напряжении в начале анализа изменяется до тех пор, пока не образуется стабильный температурный градиент. В этом состоянии основное джоулево тепло отводится через стенки капилляра. При неэффективном охлаждении температура буфера повышается, и поэтому ток увеличивается непропорционально приложенному напряжению. При этом перестает выполняться закон Ома.
В целом действием температурных эффектов можно пренебречь при работе в области выполнения закона Ома. Максимальное необходимое напряжение зависит, таким образом, от диаметра капилляра, электропроводности буфера и эффективности охлаждения.
Как ясно видно из рисунка, применение капилляра с очень маленьким внутренним диаметром позволяет повысить электрическое сопротивление, при этом одновременно увеличится линейная область U/I-кривой. Так, к примеру, с исследуемым буфером (рис. 12 А) в капилляре с внутренним диаметром 50 мкм можно работать до 25 кВ. В то же время для капилляра диаметром 100 мкм рабочая область не превышает примерно 12 кВ.
Можно повысить электрическое сопротивление, применяя цвиттер-ионный буфер. Уменьшая удельную электропроводность, можно, как показано на примере буфера, содержащего циклогексиламинопропановую кислоту (ЦАПК), работать вплоть до 20 кВ даже с капилляром, имеющим внутренний диаметр 100 мкм.
Рис. 12. А: Достигаемое число теоретических тарелок в капиллярном электрофорезе с учетом и без учета джоулева тепла. В: Зависимость уширения полос вследствие температурного эффекта от напряженности поля при различных диаметрах капилляра.
5.3 Потеря эффективности в результате электрической дисперсии
Уменьшение электропроводности буфера устанавливает, однако, некоторые ограничения. Если между электропроводностью в буфере и в зоне пробы существует большое различие, то локальное нарушение электрического поля приводит к искажениям зон и, вследствие этого, к уменьшению эффективности разделения. Если электропроводность внутри зоны пробы больше, чем в несущем электролите, то уменьшение сопротивления приводит к снижению напряженности поля. Из-за этого молекулы пробы в зоне концентрационного максимума перемещаются медленнее, чем на краях. Это приводит к сильному искажению зон с медленным подъемом и быстрым падением в них концентрации веществ. В другом случае возникает пик с большим "хвостом". Симметричный пик получается только, если электропроводности в зоне пробы и в буфере одинаковы.
Рис. 13. Увеличение силы тока в зависимости от напряжения и внутреннего диаметра капилляра.
Условия: прибор для КЭ — МП-lipore Quanta 4000; капилляр — 360 мкм (внешний диаметр), 50/56 см; буфер (А): 20 мМ борат, pH 10.0; буфер (В): 25 ММ ЦАПК. pH 11,0.
Поэтому концентрацию буфера необходимо подбирать применительно к конкретной проблеме разделения (диссоциация и подвижность пробы). Кроме того, разница в подвижности между ионами пробы и буфера может привести к изотахофоретическому эффекту. Это дает в большинстве случаев треугольную форму пика, которая вызывает проблемы при интегрировании.
При этом, если электропроводность зоны пробы больше, чем у разделительного буфера, это приводит к разбавлению пробы при ее вводе. Это объясняется законом Кольрауша, который требует постоянной электропроводности на всем участке разделения.
i — ионы в зоне разделения, ωi — функция Кольрауша.
Если при этом существует еще и разница в подвижности между ионами пробы и буфера, то происходит искажение формы пика. Эта сложная взаимосвязь наглядно обобщена еще раз в таблице 3.
Электропроводность буфера в зонном электрофорезе должна быть одинаковой на всем участке разделения. Только этим обеспечивается то, что напряжение на участке разделения падает равномерно и скачков напряженности поля не возникает.
Появление градиента напряженности электрического поля в зоне перемещения молекул пробы определяется ионной силой (или концентрацией) буфера. Если электропроводностью зоны пробы нельзя пренебречь по сравнению с электропроводностью буфера, это приводит к уширению полос. Эффект усиливается с ростом различия в подвижностях ионов пробы и буфера.
Рис. 14. Схематическое объяснение уширения полос электрической дисперсии
Из-за скачка напряжения на границе пиков происходит деформация и образуются крутой и пологий края пика. На рис 15 представлена зависимость значений Н от концентрации боратного буфера для четырех соединений. Значения Н при этом для всех веществ с увеличением концентрации буфера снизились, например, для (1-гидроксибензойной кислоты с 31 мкм до 4 мкм.
Для ионов пробы с большим отличием в подвижности от ионов буфера значение Н на несколько порядков выше, чем в случае пробы, имеющей подвижность такую же, как у ионов буфера.
Эти явления более подробно рассмотрены в главе "Непрямое УФ-детектирование", поскольку при этом способе детектирования часто необходимо использовать маленькие концентрации буфера.
Рассмотрим эти проблемы на примере разделения гомологического ряда карбоновых кислот.
В то время как низшие гомологи детектируются с отчетливым искажением, каприловая кислота выходит в виде симметричного пика. Карбоновые кислоты, перемещающиеся медленнее, обладают значительно меньшей подвижностью,